大約30年前，科學(xué)家首次描述了DNA測(cè)序的Sanger法（Sanger  et  al.,1977）?，F(xiàn)今DNA測(cè)序仍使用這項(xiàng)獲諾貝爾獎(jiǎng)的技術(shù)。測(cè)序過(guò)程中通過(guò)聚合酶結(jié)合作為鏈終止子的雙脫氧核糖核苷酸(ddNTP)，接著進(jìn)行分離，分離介質(zhì)必須可區(qū)分出單個(gè)堿基長(zhǎng)度的差別ddNTP在DNA核酸的3′末端無(wú)羥基基團(tuán)，因此，當(dāng)聚合酶結(jié)合一個(gè)ddNTP摻入到合成鏈時(shí)，鏈的延伸終止。反應(yīng)體系中含有dNTP和ddNTP，部分DNA分子能夠繼續(xù)延伸。測(cè)序反應(yīng)結(jié)束時(shí)反應(yīng)混合液中含有一系列相互之間只相差一個(gè)堿基的分子。

    圖1說(shuō)明了Sanger測(cè)序法的過(guò)程。每一條DNA鏈均在獨(dú)立反應(yīng)中用單一引物進(jìn)行測(cè)序，通常采用的是正向或反向PCR引物。用四種不同顏色熒光染料標(biāo)記四種不同的ddNTP。紅色染料標(biāo)記ddTTP（胸腺嘧啶），藍(lán)色染料標(biāo)記ddCTP（胞嘧啶），綠色染料標(biāo)記ddATP（腺瞟呤）和黃色染料標(biāo)記ddGTP(鳥(niǎo)瞟呤)，為了清晰分辨，黃色染料標(biāo)記在屏幕上顯示為黑色。熒光染料標(biāo)記，以及自動(dòng)化檢測(cè)系統(tǒng)和毛細(xì)管電泳簡(jiǎn)化了DNA測(cè)序，人類基因組計(jì)劃就是采用這些測(cè)序按術(shù)成的。

    Taq聚合酶在堿基結(jié)合過(guò)程中常常有很高的背景干擾，且結(jié)合率低，在過(guò)去IO年里，各種DNA測(cè)序法從單一的Taq聚合酶發(fā)展到今天所用的平衡性較好的Big Dye試翔盒。采用更易被熒光激發(fā)的染料提高了信噪比( Lee et a1．，1997)，現(xiàn)在可從較少的檢材中獲得結(jié)果?，F(xiàn)今每個(gè)DNA測(cè)序反應(yīng)中僅需要Ing mtDNA PCR產(chǎn)物(Stewart et a1．，2003)。

  DNA模板    3′-TAAATGATTCC-5′

5′--------→------→3′

    引物退火   A●         ddNTP終止延伸

                    AT●       產(chǎn)物以一個(gè)堿基的差額

                     ATT●      依次遞增

                      ATTT●

                       ATTTA●       每種ddMP標(biāo)記不同

                        ATTTAC●

                         ATTTACT●    顏色的熒光染料

                          ArrTACTA●

                           ATTTACTAA●

                            ATTTACTAAG●

                             ATTTACTAAGG●

                  ATTTACTAAGG   根據(jù)電泳圖譜中蜂的顏色確定序列

                  270        2          （進(jìn)行單堿基檢測(cè)）

                 圖1熒光標(biāo)記ddNTP的DNA測(cè)序過(guò)程

    設(shè)計(jì)好的引物識(shí)別DNA模板的特定區(qū)域且發(fā)生退火，并在酶的作用下延伸。因?yàn)榛旌衔镏泻写硭姆N核苷酸的dNTP和ddNTP，一些延伸產(chǎn)物由于結(jié)合了一種ddNTP產(chǎn)生終止，而另外一些繼續(xù)延伸。每種ddNTP用不同的染料標(biāo)記使每種延伸產(chǎn)物能以顏色區(qū)分。DNA序列的讀取基于延伸產(chǎn)物的片段大小，測(cè)序依賴的介質(zhì)必須足以分清每個(gè)堿基。

    mtDNA測(cè)序PCR含下列幾個(gè)步驟：①利用下列各種引物對(duì)整個(gè)或部分控制區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；②去除PcR反應(yīng)中殘留的引物和dNTP，可以采用Microcon 100超濾法過(guò)濾或用蝦一堿性磷酸酶核酸外切酶I進(jìn)行酶消化（Dugan et al ．，2002）；③對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量(Wilson et al.,1995a,1995b)；④完成PCR測(cè)序反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)管中有一段不同的引物以及熒光標(biāo)記的    ddNTP，這些引物可表明所檢測(cè)的DNA鏈；⑤通常采用微柱過(guò)濾法去除在測(cè)序反應(yīng)中未結(jié)合的熒光標(biāo)記終止劑；⑥用甲酰胺稀釋純化后的測(cè)序產(chǎn)物并利用毛細(xì)管電泳或凝膠系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行分離；⑦進(jìn)行序列分析及序列信息解釋。

    DNA序可以利用一系列儀器完成，包括ABI 310、ABI 3100和ABI377( Stewart et a1．，2003)?？捎枚嗌珶晒鈾z測(cè)儀進(jìn)行STR分析和mtDNA測(cè)序，其根本區(qū)別在于進(jìn)行DNA序列分析要求分離介質(zhì)必須能夠區(qū)分單個(gè)堿基，而STR分型則無(wú)此嚴(yán)格要求。DNA測(cè)序常用POPTM-4分離膠，而STR分型采用POPTM-4分離膠，這種凝膠具有較低的黏性和分離度。